Batch, fed-batch, continuous и perfusion: режимы работы биореактора

Это третья статья в нашем цикле о биореакторах и ферментерах. Здесь мы разберём основные режимы работы биореакторов.

Если Вы ещё не читали первую и вторую статьи об основных понятиях, различиях и ключевых узлах строения, рекомендуем начать с них:

Они создадут необходимый фундамент для понимания информации, которую мы рассматриваем в данном материале.

Почему выбор режима определяет архитектуру производства

Два биореактора рабочим объёмом 10 л с идентичной геометрией, системой перемешивания и контрольно-измерительной оснасткой, засеянные одной и той же линией CHO, дают результаты, различающиеся более чем на порядок. Классический fed-batch за 14 суток обеспечивает около 50 г моноклонального антитела. Перфузионный процесс на том же аппарате за 45 суток - 600-1000 г, то есть в 12-20 раз больше при том же объёме сосуда. Различие определяется не конструкцией аппарата, а режимом культивирования: набором правил о том, поступают ли питательные вещества в ходе процесса, отводится ли жидкость и остаются ли клетки в сосуде.

Режим культивирования выбирается на ранней стадии разработки и определяет параметры производства на весь жизненный цикл продукта: объём ёмкостей, площадь чистых помещений, глубину автоматизации, численность персонала и себестоимость единицы продукта. Стоимость ошибки на этом уровне на порядок превышает стоимость ошибки при подборе спарджера или профиля перемешивания.

Этот материал систематизирует четыре базовых режима: принцип действия, требования к оборудованию, технологические показатели и области применения. Дополнительно рассматриваются гибридные подходы.

🔬 Подбираете биореактор под конкретный процесс?

Наши инженеры помогут сопоставить режим культивирования с характеристиками оборудования: объём, тип мешалки, системы газообмена и автоматизации.

[Запросить подбор конфигурации →]

Классификационная рамка: три критерия разграничения

Всё многообразие режимов сводится к трём бинарным признакам:

1. Поступает ли субстрат в аппарат в ходе процесса;
2. Отводится ли жидкость из аппарата в ходе процесса;
3. Покидают ли клетки аппарат вместе с отводимой жидкостью.

Ключевые термины

VCD - плотность жизнеспособных клеток, кл/мл;
μ - удельная скорость роста, ч⁻¹ (для CHO: 0,02–0,035 ч⁻¹);
D - скорость разбавления, отношение расхода среды к рабочему объёму, ч⁻¹;
Титр - концентрация целевого продукта, г/л;
STY (объёмная продуктивность) - масса продукта с литра рабочего объёма в сутки; определяет требуемый парк оборудования;
IVCC - интеграл жизнеспособной клеточной концентрации по времени, клеточно-дни;
VVD - скорость перфузии, объёмов реактора в сутки;
CSPR - удельный расход среды на клетку, пл/кл/сут (для CHO: 20-50).

Batch: периодический режим

Принцип действия

В начале цикла загружается полный объём среды и вносится инокулюм. Далее система закрыта по питанию: вводятся только титранты pH, газы и пеногаситель. Культура проходит лаг-фазу, экспоненциальный рост, стационарную фазу и отмирание, после чего рабочий объём снимается целиком.

Принципиальная особенность - непрерывное изменение условий на протяжении процесса. Стационарное состояние не достигается.

Ограничивающие факторы

Завершение процесса определяется не исчерпанием субстрата, а:

Накоплением ингибирующих метаболитов: лактат (2-4 г/л), аммоний (3-5 мМ) для CHO; ацетат для E. coli;
Ростом осмоляльности: с 290-320 до 400+ мОсм/кг;
Субстратным ингибированием на старте: высокая исходная концентрация компонентов провоцирует неэффективный метаболизм.

Технологические показатели

Область применения

Скрининг клонов и DoE;
Стадии наращивания посевного материала (N-3, N-2, N-1);
Вирусные векторы и вакцины на транзиентно трансфицированных HEK293;
Традиционная пищевая ферментация.

Ограничения масштабирования: экономика. При титре 0,5–1 г/л и цикле 7 суток STY ~0,1 г/л/сут, что исключает промышленное применение для рекомбинантных белков.

Резюме: Периодический режим сохраняет значение как инструмент разработки и обязательная стадия наращивания биомассы. Как производственный режим для рекомбинантных белков вышел из практики к концу 1990-х.

Fed-batch: периодический режим с подпиткой

Принцип действия

В начале загружается базовая среда объёмом 50-60% от рабочего, затем по программе дозируется концентрированный фид. К завершению объём возрастает в 1,4-2 раза.

Историческая задача - не восполнение субстрата, а управление метаболическим потоком. Для S. cerevisiae - предотвращение эффекта Кребтри; для E. coli - подавление overflow-метаболизма с накоплением ацетата; для CHO - удержание глюкозы в диапазоне 1-4 г/л, предотвращение лактатогенеза и продление продуктивной фазы.

Стратегии подпитки

Разомкнутый контур (без обратной связи):

Постоянная скорость;
Ступенчатая/болюсная подача (промышленный стандарт для mAb);
Линейно возрастающая;
Экспоненциальная (μ-стат без обратной связи).

Замкнутый контур (по измеряемому сигналу):

DO-стат (широко применяется в микробной ферментации);
pH-стат (E. coli, Komagataella phaffii);
Управление по концентрации глюкозы (современный стандарт PAT для mAb);
Управление по ёмкостному датчику биомассы.

Требования к оборудованию

Насосы с воспроизводимой характеристикой (дрейт перистальтики: 10-20% за 14 суток);
Гравиметрический контроль подачи (разрешение 1-2%);
Запас рабочего объёма (50-100%);
Программируемый профиль подачи и блокировки;
Пересчёт концентраций на текущий объём.

Технологические показатели

Ограничения масштабирования

kLa и потребность в кислороде: при VCD 30×10⁶ кл/мл требуются микроспарджеры и обогащение O2;
Накопление CO2: в сосудах 6-10 м pCO2 > 100-150 мм рт. ст., что подавляет рост и меняет гликозилирование;
Время гомогенизации: подача концентрированного фида формирует локальные зоны экстремальных значений;
Пенообразование: нагрузка на пеногашение растёт с объёмом.

Резюме: Fed-batch - доминирующий промышленный стандарт. Оптимальное сочетание производительности, технологической зрелости и регуляторной предсказуемости. Режим выбора по умолчанию.

📊 Не уверены, какой режим подойдёт вашему процессу?

Оставьте заявку, наш инженер поможет рассчитать, какой режим и объём аппарата закрывают задачу, и покажет разницу в парке оборудования между fed-batch и перфузией.

[Оставить заявку →]

Continuous: непрерывный режим (хемостат)

Принцип действия

Свежая среда подаётся непрерывно, эквивалентный объём культуральной жидкости вместе с клетками отводится. Рабочий объём постоянен.

Баланс по биомассе:
dX/dt = (μ - D) · X

при D < μmax система приходит к стационару, где μ = D: удельная скорость роста задаётся расходом насоса;
при D > μmax клетки вымываются.

Это свойство делает хемостат незаменимым в исследованиях физиологии: только здесь возможно корректное сравнение транскриптома при разных μ при прочих равных условиях.

Терминологическое разграничение

В биофармацевтике термин «continuous» имеет два значения:

Continuous как хемостат - режим культивирования, где клетки покидают аппарат
Continuous manufacturing по ICH Q13 - производственная парадигма, связывающая upstream и downstream в непрерывный поток. На практике это перфузия на стадии культивирования + многоколоночная хроматография. Хемостат в такой схеме не применяется.

Критично: указание на поддержку continuous в спецификации требует уточнения, какое из двух значений имеется в виду.

Ограничения

Контаминация: риск накапливается пропорционально времени (30-суточный процесс = 30 суток работы стерильных барьеров);
Генетический дрейф: хемостат отбирает быстрорастущие варианты, менее продуктивные по целевому белку;
Низкая плотность для CHO: D ≤ μ, поэтому VCD ограничена 2-5×10⁶ кл/мл → низкая STY;
Длительный выход на стационар: 3-5 объёмных обменов (30-50 суток при D = 0,1 сут⁻¹);
Определение серии: требует обоснования по ICH Q13.

Область применения

Исследования физиологии и кинетики;
Производство микопротеина (Fusarium venenatum);
Одноклеточный белок на метане/метаноле;
Топливный этанол (каскады с рециклом биомассы);
Биологическая очистка сточных вод.

Резюме: Сохраняет значение как исследовательский инструмент и промышленное решение для крупнотоннажных продуктов на быстрорастущих организмах. В производстве терапевтических белков практически не применяется.

Perfusion: перфузионное культивирование

Принцип действия и отличие от хемостата

Перфузия - непрерывный процесс, где клетки отделяются от выходящего потока и возвращаются в сосуд. Среда подаётся непрерывно, отработанная среда с продуктом отводится через устройство удержания клеток, биомасса накапливается.

Удержание разрывает связь D и μ. В хемостате D ≤ μ. В перфузии подача может составлять 1-2 объёма в сутки без вымывания. Результат: VCD 50-150×10⁶ кл/мл - в 20-40 раз выше, чем в хемостате, и в 3-5 раз выше пика fed-batch.

Роль bleed

При полном удержании VCD растёт неограниченно. Поэтому стационарная перфузия обязательно включает bleed - слив части клеточной суспензии.

Баланс по биомассе:
dX/dt = (μ - k_d - D_bleed) · X

В стационаре:
D_bleed = μ - k_d

Управление bleed задаёт целевую VCD; сигнал - ёмкостный датчик биомассы или офлайн-подсчёт.

Вывод: стационарная перфузия - это хемостат с частичным удержанием клеток. При отсутствии bleed реализуется concentrated fed-batch, а не перфузия.

Специфические метрики

VVD: 0,5-2 объёма реактора в сутки;
CSPR: 20-50 пл/кл/сут для CHO (управление по CSPR снижает расход среды на 20-30%);
Коэффициент просеивания: доля продукта, проходящего через мембрану (идеал 1,0; на практике для mAb 0,9→0,6-0,8 по мере засорения).

Системы удержания клеток

Мембранные:

ATF (alternating tangential flow): диафрагменный насос, возвратно-поступательный поток, смыв гель-слоя. Наиболее распространённое промышленное решение. Меньшая сдвиговая нагрузка;
TFF (tangential flow filtration): однонаправленная рециркуляция. Проще и дешевле, но выше склонность к засорению;
Спин-фильтр: вращающийся сетчатый цилиндр. Историческое решение, ограниченное применение.

Немембранные:

Акустический сепаратор (не засоряется, но лимит ~десятки литров);
Гравитационные отстойники;
Проточные центрифуги.

Технологические показатели (CHO, mAb)

Последняя строка - основной экономический аргумент: компактная перфузионная линия по выпуску сопоставима с fed-batch в 5-10 раз большего объёма → иная площадь чистых помещений, иной уровень капитальных затрат, возможность полностью одноразовой компоновки.

Область применения

Нестабильные секретируемые белки (факторы свёртывания VIII, VIIa; ферменты для ФЗТ). Продукт покидает сосуд в течение часов, поступает в охлаждаемый сборник или на стадию захвата;
Отдельные mAb (инфликсимаб исторически производился в перфузии);
Клеточная и генная терапия (AAV, лентивирусные векторы, экспансия CAR-T);
Интенсифицированные производственные площадки (малая площадь, одноразовый upstream, связанный непрерывный downstream).

Факторы технологической сложности

Устройство удержания с корректно подобранной площадью мембраны и размером пор;
Баланс 3-4 потоков (среда, пермеат, bleed, концентрат); рассогласование 2% при 1 VVD = отклонение объёма на 20 л/сутки на каждую тысячу литров;
Защита фильтрующего элемента (мониторинг TMP, коэффициента просеивания);
Мониторинг жизнеспособности (падение на 5% при 100×10⁶ кл/мл резко ухудшает фильтруемость);
Массообмен по O2 и отвод CO2 (потребность в 10 раз выше batch);
Расход и логистика среды (1000 л при 1 VVD за 40 суток = 40 м³ среды);
Асептика длительных процессов (стерильные разъёмы, тубсилеры, замена ёмкостей без остановки);
Сопряжение с downstream (накопление в охлаждаемых ёмкостях либо непрерывный захват);
Определение серии по ICH Q13.

Разграничение continuous и perfusion при оценке оборудования

Указание на поддержку continuous ≠ готовность к перфузии.

Непрерывные приток/отток = два насоса + контроль объёма.

Перфузия дополнительно требует:

Совместимый модуль удержания клеток (ATF/TFF);
Порты необходимого диаметра и расположения;
Гравиметрический контроль массы;
Независимый контур bleed;
Логика управления, связывающая элементы.

Наличие каждой позиции подлежит проверке отдельным пунктом ТЗ.

Гибридные режимы и актуальные направления

N-1 perfusion + интенсифицированный fed-batch

Наиболее практичный и быстро распространяющийся подход.

На стадии N-1 с ATF/TFF плотность доводится до 50-120×10⁶ кл/мл за 4-7 суток;
Производственный реактор засевается при 5-20×10⁶ кл/мл (вместо 0,3-0,5);
Продуктивная фаза начинается сразу;
Длительность производственной стадии сокращается на 25-50% (с 16 до 10-12 суток) при сохранении/росте титра.

Ключевое преимущество: перфузионное оборудование размещается на стадии N-1, где объёмы малы, риски ниже, требования к валидации мягче. Технологический эффект реализуется в производственном реакторе.

Concentrated fed-batch

Ультрафильтрационная мембрана (вместо микрофильтрационной) удерживает клетки и продукт при выводе низкомолекулярных метаболитов. Титр в сосуде достигает десятков г/л, расход среды ниже, чем в перфузии. Ограничение - накопление продукта с рисками деградации/агрегации.

Динамическое управление скоростью перфузии

Управление по CSPR или по скорости потребления глюкозы / O2 в реальном времени (вместо фиксированного VVD). Сокращает расход среды, стабилизирует физиологию культуры.

Криоконсервация сверхвысокой плотности

Флаконы/криопакеты с плотностью 50–200×10⁶ кл/мл исключают 1-2 ранние стадии посевного каскада, сокращая период от разморозки до засева производства на 7-14 суток.

Сопряжённый непрерывный downstream

Полный эффект перфузии при подключении выхода к непрерывному захвату: многоколоночная хроматография, непрерывная вирусная инактивация, инлайн-разведение. Производство переходит из кампанийного режима в поточный.

PAT и цифровые двойники

Рамановская спектроскопия для онлайн-контроля глюкозы, лактата, VCD; ёмкостные датчики биомассы; гибридные модели, прогнозирующие траекторию процесса; модельно-предиктивное управление. Для 40-суточной перфузии ценность прогнозной модели выше, чем для 5-суточного batch.

Одноразовые технологии

Распространение одноразовых биореакторов (до 2000–6000 л), одноразовых модулей ATF и стерильных разъёмов сделало перфузию доступной без значительных капитальных ресурсов.

Сводная сравнительная таблица

FAQ: частые вопросы о режимах работы биореакторов

В чём принципиальная разница между continuous и perfusion?

В судьбе клеток. В хемостате клетки покидают аппарат, D ≤ μ, VCD для CHO ограничена 2-5×10⁶ кл/мл. В перфузии клетки удерживаются и возвращаются, D может составлять 1-2 объёма/сут, VCD достигает 50-150×10⁶ кл/мл. В терминологии ICH Q13 «непрерывное производство» биопрепаратов практически всегда подразумевает перфузию, а не хемостат.

Обязателен ли bleed в перфузии?

Для стационарной перфузии - да. Без слива VCD растёт неограниченно. Процесс с полным удержанием клеток и продукта - это concentrated fed-batch.

ATF или TFF?

ATF: меньше засорение (реверсивный поток), меньше сдвиг (диафрагменный насос). TFF: проще, дешевле, лучше с одноразовыми, но быстрее падает коэффициент просеивания. Для длительных процессов CHO при 30-100×10⁶ кл/мл базовый выбор - ATF.

Насколько выше расход среды в перфузии?

В 2-4 раза на кг продукта. Реактор 1000 л при 1 VVD потребляет ~1 м³/сут, за 40 суток - 40 м³. Управление по CSPR снижает расход на 20–30%.

Возможно ли внедрить перфузию на существующем fed-batch-производстве?

Полный переход требует перепроектирования и повторного регистрационного действия. Реалистично - интенсификация через N-1 perfusion: перфузионное оборудование на предпоследней стадии посевного каскада, производственный процесс сохраняет fed-batch, длительность сокращается на 25-50%.

Какие показатели - ранние индикаторы засорения мембраны?

Снижение коэффициента просеивания и рост трансмембранного давления. Косвенный предиктор - падение жизнеспособности: при 100×10⁶ кл/мл снижение на 5% высвобождает ДНК и дебрис, резко ухудшающий фильтруемость.

🧩 Собираете конфигурацию под конкретную культуру?

Сопоставим требования процесса с узлами установки: рабочий объём, тип мешалки и импеллера, спаргер и газовые линии, датчики pH и DO, охлаждение, насосы и способ стерилизации.

[Получить консультацию по конфигурации →]

Поможем выбрать лучшее решение для вашей лаборатории

Оставьте свои контакты, чтобы
получить консультацию эксперта