Культивирование клеток: типы культур, условия, этапы и оборудование

Культивирование клеток - базовая технологическая платформа для биомедицинских исследований, разработки лекарств, вирусологии и производства биофармацевтических продуктов. В этом обзоре рассмотрены основные типы клеточных культур, критические параметры микросреды, этапы процесса и функциональная роль оборудования - от CO2-инкубатора до биореактора.
🔬 Планируете организовать участок клеточного культивирования или масштабировать суспензионный процесс?

Наши специалисты помогут сопоставить требования культуры с функциональными возможностями CO2-инкубаторов, биореакторов, шейкеров-инкубаторов и другого оборудования Zhichu. Оставьте заявку, чтобы обсудить задачу.

[Оставить заявку →]

Основы культивирования клеток

Что понимают под клеточной культурой

Культивирование клеток - это поддержание и размножение клеток вне организма в искусственно созданной среде при контролируемых физических, химических и биологических условиях. Источником могут быть непосредственно изолированные ткани, кровь или костный мозг, а также ранее полученные клеточные линии.

Клетки выращивают:
  • на поверхности культуральной посуды или матрикса;
  • в жидкой суспензии;
  • на микрокарриерах;
  • в составе сфероидов, органоидов и других трёхмерных систем.

Клеточная культура отличается от тканевой тем, что в первом случае исследователь работает преимущественно с диссоциированными клетками или сформированными ими структурами, а во втором сохраняет фрагмент ткани и часть исходной архитектуры.

Главное преимущество модели in vitro - управляемость. Исследователь может независимо изменять состав среды, температуру, газовую атмосферу, плотность посева или воздействие исследуемого вещества. Однако культура остаётся упрощённой моделью: поведение клеток вне организма не полностью воспроизводит взаимодействия, кровоснабжение, иннервацию и системную регуляцию in vivo.

Для чего культивируют клетки

Клеточные культуры применяют в нескольких крупных направлениях:
  • Фундаментальная биология: изучение клеточного цикла, апоптоза, дифференцировки, сигнальных путей и взаимодействия с внеклеточным матриксом.
  • Онкология: исследование опухолевого роста, инвазии, лекарственной чувствительности и взаимодействия опухоли с иммунными клетками.
  • Вирусология: размножение вирусов, изучение их жизненного цикла, тестирование противовирусных препаратов и производство отдельных типов вакцин.
  • Фармакология и токсикология: оценка эффективности, цитотоксичности и механизма действия кандидатов в лекарственные препараты.
  • Биофармацевтическое производство: получение моноклональных антител, рекомбинантных белков, ферментов и вирусных векторов. Широко применяются клетки CHO и HEK293.
  • Регенеративная медицина: культивирование стволовых клеток, разработка протоколов дифференцировки, создание органоидов и тканеинженерных конструкций.

Выбор модели определяется не только биологической задачей. Необходимо учитывать воспроизводимость, доступность исходного материала, допустимое число пассажей и предполагаемый масштаб процесса.

От первых культур к управляемым биопроцессам

В 1907 году Росс Гаррисон показал возможность поддерживать нервную ткань эмбриона лягушки вне организма. В середине XX века появились стандартизованные среды, антибиотики и инкубаторы с контролем температуры и CO2.

В 1951 году была получена линия HeLa - первая широко распространяемая непрерывная линия клеток человека. Позднее описание предела Хейфлика показало, что нормальные соматические клетки имеют ограниченный пролиферативный потенциал, тогда как опухолевые или искусственно иммортализованные клетки способны поддерживаться значительно дольше.

Современное культивирование объединяет клеточную биологию и процессную инженерию: контролируются не только температура и состав среды, но также растворённый кислород, pH, массоперенос, перемешивание, метаболиты и качество продукта.

Типы клеточных культур

Первичные культуры

Первичные клетки получают непосредственно из ткани или биологической жидкости. Для выделения применяют механическую диссоциацию, ферментативную обработку коллагеназой, трипсином или другими ферментами, а также методы селекции отдельных популяций.

Такие культуры обычно лучше сохраняют тканеспецифические признаки, рецепторный профиль и физиологический ответ. Одновременно они характеризуются:
  • ограниченным числом делений;
  • донорской вариабельностью;
  • высокой чувствительностью к условиям изоляции и культивирования;
  • более сложной стандартизацией.

Донорские различия - например, возраст, генотип, состояние здоровья или HLA-профиль - повышают биологическую релевантность, но требуют продуманного дизайна эксперимента и достаточного числа независимых образцов.

Конечные и непрерывные клеточные линии

Термины «клеточная линия» и «непрерывная линия» не являются полными синонимами. После первого пассирования первичной культуры формируется клеточная линия, которая может оставаться конечной, то есть иметь ограниченный срок жизни. Непрерывные линии приобретают способность к длительной пролиферации вследствие опухолевой трансформации или направленной иммортализации.

Их преимущества - доступность, сравнительно простое поддержание и возможность стандартизовать процесс. Но длительное культивирование создаёт селективное давление. С увеличением числа пассажей возможны:
  • генетический и фенотипический дрейф;
  • изменение скорости роста и метаболизма;
  • отбор субпопуляций, лучше адаптированных к условиям лаборатории;
  • расхождение свойств одной линии в разных лабораториях.

Поэтому необходимы учёт пассажей, рабочий банк ранних пассажей, контроль морфологии, тестирование на микоплазму и аутентификация. Для человеческих линий часто применяют STR-профилирование.

Адгезионные культуры

Адгезионным клеткам для выживания и пролиферации требуется контакт с культуральной поверхностью или внеклеточным матриксом. К ним относятся многие эпителиальные, эндотелиальные и фибробластоподобные клетки, iPSC, мезенхимальные стромальные клетки, Vero, а также отдельные варианты HEK293 и CHO.

По мере роста клетки занимают доступную площадь. Конфлюентность показывает, какая доля поверхности покрыта клетками. При высокой конфлюентности у многих нетрансформированных культур замедляется пролиферация вследствие контактного торможения, меняются метаболизм и экспрессия генов.

Для пассирования клетки обычно отделяют трипсином, рекомбинантными протеазами или неферментативными реагентами. Масштабирование требует увеличения площади, применения многослойных сосудов, микрокарриеров либо перехода к специализированным биореакторным системам.

Суспензионные культуры

Суспензионные клетки растут в объёме среды как отдельные клетки или агрегаты. Такой формат естественен для ряда кроветворных клеток; к нему также адаптируют промышленные линии CHO и HEK293.

Пассирование нередко выполняют разбавлением до заданной концентрации. При необходимости культуру осаждают центрифугированием, заменяют среду и аккуратно ресуспендируют.

Суспензионный формат удобен для масштабирования, но предъявляет требования к:
  • однородности перемешивания;
  • газообмену и переносу кислорода;
  • контролю размера агрегатов;
  • ограничению сдвиговых напряжений;
  • стабильности плотности посева.

Адгезионные и суспензионные культуры: сравнение

Формат роста выбирают по биологии клеток и целевому процессу. Перевод линии в суспензию - это не простая смена посуды, а адаптация, способная изменить фенотип, продуктивность и требования к среде.

Условия культивирования

Температура

Для большинства клеток человека и других млекопитающих используют около 37 °C. Клетки насекомых часто культивируют примерно при 27 °C, птичьи клетки - при более высокой температуре, а культуры холоднокровных животных - при более низкой.

Критично не только заданное значение, но и его стабильность. Частое открывание дверцы инкубатора, длительные манипуляции вне камеры и недостаточная калибровка увеличивают вариабельность процесса. Температура влияет на метаболизм, текучесть мембран, растворимость газов и положение кислотно-основного равновесия.

CO2, кислород и pH

Большинство сред для клеток млекопитающих содержит бикарбонат натрия. Газообразный CO2 растворяется в среде и участвует в бикарбонатной буферной системе. Сочетание концентрации бикарбоната и парциального давления CO2 поддерживает pH, обычно около 7,2–7,4.

Часто используют 5% CO₂, но требуемое значение определяется конкретной рецептурой среды. Недостаток CO2 сдвигает pH в щелочную сторону, избыток - в кислую.

В стандартном CO2-инкубаторе кислород близок к атмосферному уровню с поправкой на присутствие CO2 и водяного пара. Однако для моделирования физиологической гипоксии, работы со стволовыми, опухолевыми и другими чувствительными культурами применяют трёхгазовые инкубаторы. Они позволяют независимо управлять O2, как правило, за счёт подачи азота для снижения его концентрации.

HEPES и другие органические буферы повышают устойчивость pH во время операций вне инкубатора, но не отменяют необходимость согласовывать среду с газовой атмосферой.

Газообмен и перемешивание

В статических культурах кислород поступает через поверхность жидкости. С увеличением глубины среды и плотности клеток диффузии может быть недостаточно.

В шейкерных колбах перемешивание обновляет поверхность контакта жидкости с газом, уменьшает градиенты и препятствует оседанию. В биореакторах применяют поверхностную подачу газа, барботаж или мембранный газообмен.

Интенсивность воздействия должна оставаться безопасной для клеток. Слишком слабое перемешивание вызывает оседание и неоднородность, слишком сильное - сдвиговой стресс и повреждение, особенно в зоне пузырьков. В отдельных суспензионных процессах используют защитные добавки, например полоксамер 188, известный также как Pluronic F-68.

Питательные среды

Полноценная среда содержит:
  • неорганические соли для осмотического баланса и мембранного потенциала;
  • аминокислоты, включая источник азота - часто L-глутамин или его стабильные производные;
  • глюкозу либо другой энергетический субстрат;
  • витамины и микроэлементы;
  • буферную систему;
  • факторы роста, гормоны, липиды и транспортные белки - в зависимости от рецептуры.

Фетальная бычья сыворотка обеспечивает широкий набор питательных и регуляторных компонентов, но вносит межпартийную вариабельность и усложняет регуляторный контроль. Сывороточно-свободные среды не обязательно являются химически определёнными: они могут содержать компоненты неизвестного состава. В химически определённой среде известны все вещества и их концентрации.

Выбор среды влияет не только на скорость роста. Он способен изменять морфологию, метаболизм, экспрессию маркеров и качество целевого продукта.

Стерильность и контаминация

Асептическая техника включает стерильные расходные материалы, обработку поверхностей, сокращение времени открытых манипуляций и правильную организацию потоков внутри шкафа.

Антибиотики не заменяют асептику. Их постоянное использование способно маскировать низкоуровневую бактериальную контаминацию и не защищает от большинства микоплазм.

Микоплазма особенно опасна: она может не вызывать видимой мутности, но менять рост, метаболизм и экспрессию генов. Для контроля применяют ПЦР, люминесцентные и другие валидированные методы. При подтверждённой контаминации рабочую культуру обычно утилизируют, проводят деконтаминацию и восстанавливают линию из чистого банка.

Этапы культивирования клеток

1. Подготовка

До начала работы определяют:
  • происхождение и подлинность линии;
  • допустимый диапазон пассажей;
  • состав среды и газовую атмосферу;
  • тип культуральной поверхности;
  • плотность посева;
  • критерии жизнеспособности и готовности к пассированию.

Среды с термолабильными компонентами стерилизуют фильтрацией, а не автоклавированием. Исходные клетки проверяют на контаминацию, включая микоплазму.

2. Посев

Посев, или инокуляция, - перенос клеток в свежую среду при заданной начальной плотности. Слишком низкая плотность может увеличить период адаптации и снизить выживаемость; слишком высокая приводит к раннему истощению среды и затрудняет получение воспроизводимой кинетики.

После размораживания клетки быстро освобождают от длительного воздействия ДМСО. Необходимость центрифугирования зависит от типа клеток и протокола: для чувствительных культур дополнительное осаждение может само по себе стать источником потерь.

3. Рост популяции

После посева условно выделяют несколько периодов:
  • Лаг-фаза: адаптация, прикрепление адгезионных клеток, восстановление после диссоциации или размораживания.
  • Экспоненциальная фаза: устойчивое увеличение числа клеток. Для многих анализов используют культуру в активном росте.
  • Замедление и плато: пролиферация ограничивается площадью, питательными веществами, кислородом или накоплением метаболитов.
  • Снижение жизнеспособности: увеличивается доля клеток в апоптозе и некрозе.

Для культур млекопитающих термин «стационарная фаза» используют осторожно: плато не всегда означает точное равенство скоростей деления и гибели, как в классическом описании бактериального batch-процесса.

4. Пассирование

Пассирование - перенос части культуры в свежие условия для продолжения роста.

Адгезионные клетки промывают, отсоединяют подходящим реагентом, нейтрализуют или удаляют его и пересевают. Чрезмерная экспозиция протеаз повреждает поверхностные белки и может влиять на последующие анализы.

Суспензионные культуры разбавляют либо осаждают и ресуспендируют. Центрифугирование само по себе не разрушает агрегаты: их диспергируют контролируемым пипетированием или другим валидированным способом.

Каждый пассаж создаёт селективное давление, поэтому его номер необходимо фиксировать вместе с датой, плотностью, жизнеспособностью и отклонениями от протокола.

5. Сбор и криоконсервация

Клетки собирают для аналитики, дальнейшего масштабирования или создания банка. При криоконсервации используют криопротектор, чаще ДМСО, и контролируемое охлаждение. Для долгосрочного хранения обычно применяют температуры ниже -130 °C, включая паровую или жидкую фазу азота.

Рациональная система банков включает исходный и рабочий банки. Такой подход сокращает число пассажей и позволяет вернуться к охарактеризованному материалу после дрейфа или контаминации.

Оборудование для культивирования клеток: функциональный взгляд

CO2-инкубаторы

CO2-инкубатор поддерживает температуру, концентрацию углекислого газа и влажную атмосферу. Через взаимодействие CO2 с бикарбонатной системой он косвенно стабилизирует pH среды.

Функционально важны не только поддержание заданных значений, но и быстрое восстановление условий после открытия дверцы, равномерность микросреды, возможность очистки и регулярной калибровки. Высокая влажность снижает испарение, но одновременно требует дисциплины санитарного обслуживания.

Трёхгазовые инкубаторы

Трёхгазовые системы контролируют CO2 и O2 и применяются там, где атмосферный кислород не соответствует биологической модели. Они востребованы при исследованиях гипоксии, культивировании отдельных стволовых и опухолевых клеток, а также при моделировании тканеспецифической кислородной среды.

Шейкеры и шейкеры-инкубаторы

Шейкер обеспечивает контролируемое движение жидкой культуры. Шейкер-инкубатор дополнительно поддерживает температуру, а специализированные системы для клеток млекопитающих - требуемую газовую атмосферу.

Их задачи:
  • удерживать клетки во взвешенном состоянии;
  • уменьшать градиенты субстратов и метаболитов;
  • усиливать газообмен;
  • обеспечивать воспроизводимый переход к биореактору.

Режим перемешивания рассматривают вместе с геометрией сосуда, рабочим объёмом и чувствительностью клеток. Одинаковая частота вращения в разных колбах не гарантирует одинакового гидродинамического режима.

Биореакторы и ферментеры

Биореактор переводит процесс от поддержания культуры к управляемому масштабированию. Он позволяет контролировать pH, температуру, растворённый кислород, перемешивание, подачу газов и питательных компонентов.

Термин «ферментер» традиционно чаще применяют к микробным процессам, а «биореактор» - шире, включая культуры клеток млекопитающих. Принципиальное отличие от шейкерной колбы - возможность измерять критические параметры и управлять ими по обратной связи.

Шкафы биологической безопасности и ламинарные боксы

Необходимо различать чистый ламинарный бокс и шкаф биологической безопасности. Первый преимущественно защищает продукт. Шкаф биологической безопасности класса II при правильной эксплуатации защищает культуру, оператора и окружающую среду и поэтому обычно предпочтителен для работы с клетками и потенциально опасным биоматериалом.

Центрифуга и микроскоп

Центрифуга нужна для осаждения, промывки и концентрирования клеток, замены среды и отделения клеточной массы от супернатанта. Режим выбирают по относительному центробежному ускорению, времени, температуре и чувствительности культуры.

Инвертированный фазово-контрастный микроскоп обеспечивает ежедневный контроль морфологии, конфлюентности, прикрепления и агрегатов. Он помогает заметить многие виды контаминации, но не заменяет специализированное тестирование на микоплазму и аутентификацию.

Частые вопросы о культивировании клеток

Почему клетки млекопитающих нельзя постоянно выращивать при комнатной температуре?

При 20–25 °C замедляются ферментативные реакции, транспорт через мембраны и клеточный цикл. Кратковременное охлаждение некоторые линии переносят, но регулярные температурные отклонения снижают воспроизводимость. Исключение - клетки организмов, физиологически адаптированных к другим температурам.

Зачем CO2, если клетки используют кислород?

CO2 нужен прежде всего для равновесия бикарбонатного буфера и поддержания pH. Кислород участвует в клеточном дыхании, а CO2 в данном контексте выполняет преимущественно кислотно-основную функцию.

Можно ли работать без ламинарного шкафа?

Для рутинной культуры это резко повышает риск контаминации. При работе с клетками и биологическим материалом обычно используют шкаф биологической безопасности соответствующего класса, а не обычный чистый бокс.

Что лучше: первичные клетки или непрерывная линия?

Универсально лучшего варианта нет. Первичные клетки обычно физиологически релевантнее, но вариабельнее и сложнее в работе. Непрерывные линии удобны для стандартизации, скрининга и масштабирования, однако могут значительно отличаться от исходной ткани.

Почему адгезионные клетки отсоединяют ферментами?

Протеазы разрушают белковые связи клеток с поверхностью и друг с другом. Метод обеспечивает более мягкое отделение, чем грубое соскабливание, но продолжительность обработки должна быть ограничена.

Всегда ли нужна сыворотка?

Нет. Многие процессы ведут в сывороточно-свободных или химически определённых средах. Переход требует адаптации и повторной оценки роста, фенотипа и продуктивности клеток.

Как распознать контаминацию?

Бактерии, дрожжи и грибы могут вызывать мутность, хлопья, изменение цвета среды и появление посторонних структур под микроскопом. Микоплазма часто не имеет заметных визуальных признаков, поэтому требуется регулярное тестирование.

Заключение

Стабильная клеточная культура возникает не за счёт одного «правильного» прибора или реагента, а благодаря согласованию всей системы. Тип клеток определяет формат роста; формат - требования к поверхности, перемешиванию и газообмену; состав среды связывает pH с CO2; плотность и стадия роста задают момент пассирования или сбора.

Оборудование должно поддерживать биологический процесс, а не компенсировать неопределённость протокола. CO2-инкубатор стабилизирует микросреду, трёхгазовый - дополнительно управляет кислородом, шейкер обеспечивает гидродинамику, а биореактор объединяет измерение и регулирование параметров при масштабировании.

Практический результат системного подхода - снижение межсерийной вариабельности, более предсказуемый рост и возможность корректно переносить процесс от культурального флакона к шейкерной колбе и далее к биореактору.
🚀 Подберите оборудование под конкретную культуру и технологический маршрут

Мы предлагаем CO2- и трёхгазовые инкубаторы, шейкеры, шейкеры-инкубаторы, биореакторы и ферментеры Zhichu. Оставьте заявку - наши специалисты уточнят тип клеток, формат культивирования, рабочий объём и требования к газовой среде, чтобы сформировать обоснованное решение.

[Оставить заявку →]

Поможем выбрать лучшее решение для вашей лаборатории

Оставьте свои контакты, чтобы 
получить консультацию эксперта